La película comienza narrando la infancia de Leónidas y su entrenamiento para ser el próximo rey espartano, que superó, para asombro de todos, matando semidesnudo a un gigantesco lobo con una lanza de madera en mitad de una tormenta de nieve. Un día, siendo ya monarca de Esparta, llega a visitarlo un emisario persa del rey Jerjes que le comunica la exigencia de pagar un tributo de tierra y agua como prueba de la sumisión de la polis hacia Persia. Leónidas se niega y tira a un pozo al emisario y a sus escoltas. Después de esto consulta a los Éforos la posibilidad de que la ciudad estado entre en guerra contra los aqueménidas, aunque éstos deniegan su solicitud augurando un destino nefasto para toda Grecia después de haber sido sobornados por Jerjes.
Decidido a plantarle cara al ejército persa sin transgredir en ningún momento la ley, manda a su capitán más fiel a que reúna un contingente de 300 guerreros espartanos (insuficientes para ser considerados un ejército en toda regla que comprometiese la posición política de la polis) con los que se dirigirá al paso de las Termópilas a detener el avance invasor. Por el camino, un grupo de arcadios se les unen después de que Leonidas, tras ser cuestionado por los pocos hombres a los que envía al combate, demuestre que lo que Ardadia lleva a la muerte son civiles armados mientras que sus subordinados son todos ellos soldados profesionales.
Ya en el desfiladero, y tras comprobar en su periplo los genocidios perpetrados por los persas, Leónidas detiene a varias oleadas de guerreros a los que logra aniquilar sin sufrir ninguna baja. Asombrado ante la situación, Jerjes se entrevista con Leónidas, y le ofrece ser el caudillo de toda Grecia a cambio de que lo acepte como su Dios y soberano, a lo que el espartano se niega prometiéndole a su vez que será capaz de demostrarle al final de la contienda que hasta un rey que se cree con poder divino puede sangrar. Tras el intento infructoso de parlamento, el monarca persa envía contra los 300 a su cuerpo de élite, los Inmortales, a los que acompañarán toda clase de criaturas monstruosas como gigantes, rinocerontes, engendros humanoides o elefantes de guerra. Pero aunque éstos consiguen que los espartanos sufran sus primeras muertes, los helenos logran aguantar la posición de forma heroica provocando que el las filas aqueménidas caigan numerosas cabezas.
Mientras tanto, en Esparta, debido a la ausencia de Leónidas, Theron, un consejero influyente de ideología pro-persa, centra todos sus esfuerzos en evitar que la polis apoye a Leónidas en su lucha contra Jerjes. Sin embargo la esposa del monarca no está dispuesta a que su marido muera sin ayuda en las Termópilas y acepta el chantaje del político consistente en tener sexo degenerado con él a cambio de que éste le otorgue la posibilidad de poder comparecer ante el Consejo. Pero tras concedérselo, y durante la celebración del mismo, Theron desacredita a la reina hablando de su adulterio y la injuria calificándola de furcia. Ésta, ofendida, atraviesa por sorpresa al orador con una espada cayéndosele, en ese instante, una bolsa de monedas con la efigie de Jerges, que demostraban su condición de traidor.
Pasados dos días de combate, Efialtes, un hombre deforme y jorobado exiliado de Esparta que había visitado a Leónidas con anterioridad para ofrecerle sus servicios (que había rechazado al poseer un cuerpo incapaz de compatibilizarse con la falange espartana) visita a Jerjes, y a cambio de un uniforme, riqueza, lujos y mujeres, le habla al líder aqueménida de la Senda Anopea que le permitirá llegar hasta la retaguardia de Leónidas. Tras conocerse la noticia, los arcadios huyen, pero el rey espartano se niega a retirarse, en cumplimiento de la ley espartana, para morir allí, no sin antes enviar a uno de sus soldados, Dilios.
